凱氏定氮法是目前使用最為廣泛、經(jīng)典的蛋白質(zhì)含 量測(cè)定方法，也是蛋白質(zhì)檢驗(yàn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。該方 法操作簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性和重現(xiàn)性好，廣泛應(yīng)用 于各種食品、飼料、水產(chǎn)等行業(yè)的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。 蛋白質(zhì)中含有一定比例的氮元素，氮元素含量與蛋白質(zhì) 的含量存在一定的轉(zhuǎn)換關(guān)系，即氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)， F[1]。凱氏定氮法首先測(cè)定樣品中氮的質(zhì)量，再乘以F 值即為樣品中的蛋白質(zhì)質(zhì)量。 通常情況下，蛋白質(zhì)含氮量在16% 左右，其 F 值 為6.25。但是，實(shí)際上不同來(lái)源的蛋白質(zhì)的氨基酸組成 差別很大，含氮量的差別也很大，如乳制品、面粉、 花生的蛋白質(zhì)含氮量分別為15.67%、17.54% 和18.32%， 則它們的F 值分別為6.38、5.70 和5.46[1]。
對(duì)于魚類蛋 白而言，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沒有列出其F 值，研究人員普遍 引用肉及肉制品的F 值(6.25)來(lái)計(jì)算其蛋白質(zhì)含量。但作 者在研究魚肉蛋白過(guò)程中多次發(fā)現(xiàn)，按此系數(shù)計(jì)算所得 的蛋白質(zhì)含量常常遠(yuǎn)高于魚肉酸水解氨基酸的總量，魚 蛋白粉的蛋白含量測(cè)定結(jié)果往往超過(guò)100%。最初作者 認(rèn)為誤差源自不準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)系數(shù)(6.25)，所以在現(xiàn)有的 文獻(xiàn)基礎(chǔ)上計(jì)算了魚肉蛋白含氮量并推導(dǎo)了F 值，結(jié)果 顯示魚肉蛋白含氮量在14% 左右，絕大部分魚蛋白的真 實(shí)F 值在7.0～7.5 之間。然而如果根據(jù)此系數(shù)計(jì)算魚肉蛋白質(zhì)含量則勢(shì)必造成計(jì)算結(jié)果更大的偏離。經(jīng)初步分 析，筆者判斷該誤差源自魚肉中存在的非氨基酸態(tài)氮 (non-amino acid nitrogen，NAN)，如氧化三甲胺及其 分解產(chǎn)物、尿素、生物堿等，它們的存在虛高了魚肉 的蛋白質(zhì)含量。 為了使凱氏定氮法能夠準(zhǔn)確的測(cè)定魚肉及魚肉制品 中的蛋白質(zhì)含量，并客觀、真實(shí)的評(píng)價(jià)魚蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng) 價(jià)值，本文針對(duì)氮換算蛋白質(zhì)系數(shù)和如何去除魚肉中非 氨基酸態(tài)氮的干擾進(jìn)行研究，并探討可行的改進(jìn)措施。
1 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理
蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和硫酸 銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨 與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用 硼酸吸收后，以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定，根據(jù)酸 消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量 的計(jì)算公式如式(1)、 (2)。 (V1 －V2)×c×0.0140×V3 w1/%=——————————————×100 (1) m×V4 w/%= w1×F (2) 式中：w 為試樣中蛋白質(zhì)的含量/(g/100g)；w1 為試樣中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；V1 為試樣消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn) 滴定液的體積/mL；V2 為試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn) 滴定液的體積/mL；V3 為試樣消化液的定容體積/mL； V4 為堿化蒸餾的試樣消化液體積/mL；c 為硫酸或鹽酸 標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度/(mol/L)；0.0140 為1.0mL 硫酸(c(1/2 H2SO4)=1mol/L)或鹽酸(c(HCl)=1mol/L)標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)?shù)?氮的質(zhì)量/g；m 為試樣的質(zhì)量/g 或體積/mL；F 為氮換 算為蛋白質(zhì)的系數(shù)：一般食物為6.25，乳制品為6.38， 面粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為 5.95，大豆及其制品為5.71，肉與肉制品為6.25，大米、 小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為5.30。F 值計(jì)算方法見公式(3)和(4)[2]。 ∑ N/%=—————×100 (3) ∑Ci F=100/N (4) 式中：N 表示蛋白質(zhì)中總氮含量/%；F 表示氮換算 為蛋白質(zhì)的系數(shù)；C 表示樣品中各氨基酸的百分含量/%； n 表示氨基酸分子中所含氮原子數(shù)；W 表示氨基酸的相 Cini Wi×14
對(duì)分子質(zhì)量；14 表示氮原子的相對(duì)原子質(zhì)量；i 取值 1 到 18，表示計(jì)算蛋白質(zhì)氮含量所統(tǒng)計(jì)的 18 種氨基 酸。 由式(2)可知，試樣蛋白質(zhì)含量測(cè)定值是否準(zhǔn)確只 與兩個(gè)因素相關(guān)，即試樣氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w1)和氮換算蛋 白質(zhì)的系數(shù)(F)。如要采用凱氏定氮法準(zhǔn)確測(cè)定試樣的真 實(shí)蛋白質(zhì)含量，則必須已知正確的F 值并測(cè)定得出試樣 真實(shí)的蛋白質(zhì)的氮含量(排除非蛋白質(zhì)氮干擾)。目前國(guó) 家標(biāo)準(zhǔn)和水產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定蛋白質(zhì)的方法(凱氏定氮 法)中都沒有專門為魚類明確標(biāo)示氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)， 研究人員和水產(chǎn)行業(yè)相關(guān)從業(yè)人員普遍采用肉與肉制品 的換算系數(shù)(6.25)。為了改進(jìn)測(cè)定魚及魚肉制品蛋白質(zhì)含 量的凱氏定氮法，有必要針對(duì)蛋白質(zhì)換算系數(shù)和如何去 除魚肉中非氨基酸態(tài)氮的干擾展開深入的探討。
2 凱氏定氮法在魚蛋白測(cè)定中遇到的問(wèn)題分析
2.1 魚類氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù) 基于文獻(xiàn)報(bào)道的40種魚類的肌肉氨基酸分析結(jié)果[3-36]， 按照公式(3)計(jì)算得到了40 種魚類的氨基酸態(tài)氮(aminoacid nitrogen，AN)含量，根據(jù)公式(4)推導(dǎo)出了40 種魚 類的F 值(表 1)。由表1 可見，40 種魚的F 值均高于目 前常采用的6.25，除淡水魚魴、羅非魚和瓣結(jié)魚F 值在 6.7 左右，淡水石首魚F 值為7.9 外，絕大部分魚類的 F 值在7.0～7.5 之間。
表 2 和表3 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，鯔魚不同部位、軍曹 魚不同生長(zhǎng)階段以及文昌魚不同性別對(duì)氨基酸態(tài)氮含量 (AN)的影響很小，F(xiàn) 值變異系數(shù)均小于1%；3 種海水 魚(黃顙魚、石斑魚、鯔魚)在不同生長(zhǎng)方式(野生/ 飼養(yǎng)) 下氨基酸態(tài)氮含量的變異系數(shù)均小于1.5%。表4 所示的 絕大部分海水魚的肌肉和卵的氨基酸態(tài)氮含量的變異系 數(shù)小于1.5%。由此可見，同一種屬魚類的不同性別、 不同部位、不同組織、不同生長(zhǎng)階段、不同生長(zhǎng)方式 以及肌肉與卵的氨基酸態(tài)氮含量的變異程度很小，F(xiàn) 值 非常接近。由此初步推斷，同一種屬魚類的F 值相對(duì) 固定，在凱氏定氮法測(cè)定魚類蛋白質(zhì)含量時(shí)，同種屬 魚類采用相同氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)是可行的。 2.2 魚類非氨基酸態(tài)氮含量(NAN)分析 如上所述，非氨基酸態(tài)氮是凱氏定氮法測(cè)定魚蛋白 質(zhì)的另一主要干擾因素。從表5 和表6 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可見， 魚類的非氨基酸態(tài)氮含量(NAN)差異巨大。30 種不同種 屬的魚類(海水魚類和淡水魚類)的非氨基酸態(tài)氮的含量差 別在2%～30%，并且同一種屬魚類的非氨基酸態(tài)氮含量 的變異性也很大(變異系數(shù)多在50% 左右)。雖然統(tǒng)計(jì)樣 本量有限，但是由表6 可以看出，同一種屬魚類所處不同育成方式(野生/ 飼養(yǎng))其非氨基酸態(tài)氮含量也會(huì)產(chǎn)生明 顯差別；鯔魚不同部位的非氨基酸態(tài)氮含量差別很大； 雌雄文昌魚非氨基酸態(tài)氮含量也有差別。
鮮活魚類的非氨基酸態(tài)氮主要是肌肉內(nèi)的氧化三甲 胺、尿素、嘌呤和嘧啶堿基、咪唑化合物、胍基化 合物以及甜菜堿類化合物。魚死后貯藏過(guò)程中在微生物 和酶的作用下還會(huì)分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生小分子的氨及胺類 化合物使魚體的非氨基酸態(tài)氮含量升高，其生成量與魚 體的腐敗程度有相關(guān)性[37]。由上述分析可得出一個(gè)結(jié) 論：不同種屬魚類，或同種屬的魚類(海水魚類或者淡 水魚類)，其非氨基酸態(tài)氮含量都存在巨大差異。特別是，魚類還會(huì)因?yàn)橘A藏過(guò)程而導(dǎo)致魚體非氨基酸態(tài)氮的 含量差異。魚類非氨基酸態(tài)氮含量的不確定性為魚肉蛋 白質(zhì)含量測(cè)定帶來(lái)了一定的困難。如果要采用凱氏定氮 法準(zhǔn)確測(cè)定魚肉蛋白質(zhì)含量，則首先要排除非氨基酸態(tài) 氮的干擾。
3 改進(jìn)措施的探討
鮮活魚類的非氨基酸態(tài)氮(氧化三甲胺、尿素、嘌 呤和嘧啶堿基、咪唑化合物、胍基化合物以及甜菜堿 類化合物)和魚死后貯藏過(guò)程中在微生物和酶的作用下產(chǎn) 生的氨及胺類化合物具有揮發(fā)性，可采用揮發(fā)性鹽基氮 的測(cè)定方法(GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 的分析方法》 [38])由凱氏定氮裝置在堿性溶液中將這類堿 性含氮物質(zhì)蒸餾出來(lái)，以硼酸溶液回收�；厥盏姆前� 基酸態(tài)氮含量采用凱氏定氮的方法測(cè)定，計(jì)算非氨基酸 態(tài)氮的含量。 因此，可行的凱氏定氮法測(cè)定魚類蛋白質(zhì)含量的公 式為： w/%=(w1－w2)×F (5) 式中：w 為試樣中蛋白質(zhì)的含量/%；w1 為試樣中 總氮的含量/%；w2 為試樣中非氨基酸態(tài)氮的含量/%； F 為已知的某種魚類的氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)。
4 結(jié) 論
通過(guò)對(duì)30 種魚類中非氨基酸態(tài)氮含量的分析，證 實(shí)非氨基酸態(tài)氮是凱氏定氮法測(cè)定魚蛋白質(zhì)含量的主要 干擾因素。通過(guò)對(duì)40 種魚類氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)的統(tǒng)計(jì) 分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前所普遍采用的F值(6.25)與其真實(shí)F值(7.0～ 7.5)相差很大，這給氮換算魚蛋白質(zhì)含量時(shí)帶來(lái)了一定 的誤差。本文還簡(jiǎn)述了采用揮發(fā)性鹽基氮檢測(cè)方法測(cè)定 魚肉中非氨基酸態(tài)氮的措施：在測(cè)定的總氮數(shù)值基礎(chǔ)上 扣除其非氨基酸態(tài)氮含量，再以真實(shí)F 值換算魚蛋白質(zhì) 含量，測(cè)定結(jié)果將更加可靠。
